Test toksičnosti na zarodkih rib cebric

Zarodek ribe cebrice predstavlja izjemen model za toksikološke študije, ker je dinamičen in interaktiven sistem z različnimi organi, ki se pojavljajo tudi v odraslem osebku. Model predstavlja alternativni sistem, ki v EU že nadomešča študije na poskusnih živalih zaradi etičnih in pravnih razlogov. Po novi Evropski direktivi za zaščito ljudi in okolja - REACH (ang. Registration, Evaluation, Authorisation and restriction of CHemicals) je potrebno upoštevati načelo o zmanjševanju, izboljševanju in zamenjavi poskusnih živali z alternativnimi in vitro modeli (3R concept - ang. Reduction, Refinement, Replacement).

Na voljo je brošura z navodili za izvajanje toksikoloških testov na zarodkih rib cebric in predstavitvena zgoščenka oz. CD. Za več informacij pišite na metka.filipic@nib.si ali tina.elersek@nib.si.

Na Nacionalnem inštitutu za biologijo v Ljubljani smo vpeljali test akutne strupenosti na zarodkih rib cebric in ga nadgradili še z nekaterimi dodatnimi testi, ki povezujejo različne ravni biološke organizacije:

Test akutne strupenosti

Določitev vrednosti akutne toksičnosti (LC50) za izbrane snovi poteka v skladu z SIST ISO 7346-3:1998 in 5667-16 ter OECD smernico testa na zarodkih rib (OECD Draft). Za oceno strupenosti uporabljamo 4 letalne morfološke znake, in sicer po 24 in 48 urah po oploditvi zarodkov.

Test razvojne strupenosti

Poglobljeno znanje o razvojnih stadijih zarodkov cebric (embriologija) nam omogoča, da poleg letalnih, ovrednotimo tudi subletalne in teratogene učinke, ki nam nakazujejo potencialno nevarnost dolgodobnega delovanja strupenih snovi.

Test strupenosti za izbrane organe

Namen teh študij je usmerjeno delovanje določenih snovi na organ ali skupino organov. Zasledujemo lahko oboje, morfološke in funkcionalne znake razvoja. Pomemben subletalni znak, bitje srca, lahko opazujemo že 24 ur po oploditvi zarodka. Ostali organi (možgani, oči, krvne celice…) se razvijejo v 48 urah po oploditvi, kar nam omogoča opazovanje nevrotoksičnosti, kardiotoksičnosti ipd.

Nanotoskičnost

Model zarodkov cebric predstavlja hiter in učinkovit sistem za ugotavljanje strupenosti nanomaterialov na osnovi nekaterih morfoloških in fizioloških razvojnih znakov. Nanodelci so namreč dovolj majhni, da prehajajo ovojnico zarodkov cebric.

Genotoksičnost

Za oceno genotoksičnosti snovi smo razvili test komet s katerim zaznamo poškodbe DNK pri posameznem zarodku po 24 urah. Metoda je izredno občutljiva, saj lahko zazna poškodbe DNK že v nano-gramskih koncentracijah.

Ekotoksičnost

Ekotoksikološke študije potekajo v skladu z evropskimi OECD smernicami. Smernici OECD 210 in 212 priporočata cebrice kot primeren organizem za testiranje strupenosti snovi za okolje. V procesu sprejemanja je osnutek OECD smernice za test strupenosti na zarodkih rib, ki bo služil kot alternativa obstoječemu akutnemu testu strupenosti na odraslih ribah (OECD 203). Ti testi so zelo primerni za določanje ekotoksičnosti, saj nam dajo hitre odgovore o strupenosti, ki se pojavlja zaradi onesnaževanja in/ali obremenjevanja voda, toksičnih cvetenj cianobakterij, potencialnih bioloških in/ali kemičnih terorističnih napadov ipd.

Toksikogenomika

Toksikogenomika je dokaj nova disciplina, ki omogoča poglobljene toksikološke študije mehanizmov delovanja strupenih snovi. Ta pristop je osnovan na spremembah stopnje izražanja genov (transkriptomika), kot posledice prisotnosti strupenih snovi. Analiziramo izražanje specifičnih Danio rerio homologov človeških genov za p53, p21 (pak2a in pak2b), gadd45a in mdm2. Analiza poteka s pomočjo verižne reakcije s polimerazo v realnem času (RT-PCR).

Testi strupenosti po meri naročnika

Poleg navedenih testov, izvajamo tudi teste, ki so osredotočeni na točno določene odzive živih organizmov. Testi so prilagojeni glede na trajanje, izpostavljenost in izbiro razvojnih znakov, ki jih opazujemo in ovrednotimo.

Glavne prednosti modela zarodka ribe cebrice za toksikološke študije so:

kompleksnost vseh fizioloških in morfoloških povezav, ki se pojavljajo tudi v odraslem osebku in vivo,
povezanost procesov v celostnem sistemu (zarodku) predstavlja dodatne prednosti v primerjavi s sistemom celičnih linij in/ali tkiv in vitro,
v primerjavi z glodavci imajo hiter razvoj in višjo genetsko podobnost z ljudmi,
dobra korelacija s sesalskimi modeli,
majhna velikost (~ 1 mm), teža (< 1 mg) in prosojnost zarodkov omogočajo enostavno opazovanje pod mikroskopom,
testi se izvajajo na mikrotiterskih ploščah, kar omogoča manjšo porabo testnih snovi in velik potencial za avtomatizacijo zamudnih procesov,
vse večja popularnosti tega sistema omogoča veliko bazo podatkov in izmenjavo informacij.