Mikrobiologija

Submit to FacebookSubmit to Google PlusSubmit to TwitterSubmit to LinkedInNatisni

Mikrobiologija

Na mikrobiološkem odseku oddelka raziskujemo biologijo, biotsko raznovrstnost in epidemiologijo mikrobov, ter razvijamo nove pristope in metode za potrjevanje in sledenje prisotnosti bakterij, fitoplazem in virusov. Inovativne pristope uporabljamo tudi pri pripravi vzorcev rastlin, voda in drugih vzorcev iz okolja. Kot možne pristope za obvladovanje rastlinskih bolezni raziskujemo zatiranje škodljivce z biološkimi sredstvi. Naše raziskave so osredotočene na patogene rastlin in nekatere mikrobe, patogene za ljudi in živali.

Metode, ki jih uporabljamo

Temeljna metoda, ki jo v našem laboratoriju uporabljamo in izpopolnjujemo že več let je molekularna kvantitativna metoda verižne reakcije s polimerazo (qPCR). Da bi izboljšali možnost sledenja izbranega organizma, danes metodo qPCR dopolnjujemo z digitalno PCR (dPCR), metodo določanja črtnih kod DNA (»DNA barcoding«) in tehnologijami naslednjih generacij sekvenciranja (NGS). Del raziskav je posvečen razvoju in implementaciji hitrih in enostavnih molekularnih metod, namenjenih uporabi neposredno na terenu (metoda LAMP). Nabor vseh novih metod pa dopolnjujemo s klasičnimi mikrobiološkimi metodami, serološkimi metodami (IF in ELISA), klasično metodo PCR in transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM).

Poleg metod detekcije smo tudi strokovnjaki na področju izolacije in koncentriranja nukleinskih kislin iz težavnih rastlinskih in okoljskih vzorcev, ter krme in hrane. Razvili in izpopolnili smo tudi svoje monolitno kromatografske metode za koncentriranje, čiščenje in odstranjevanje virusov iz vod.

 

Bakterije

Naše bakterijske raziskave so usmerjene v učinkovito odkrivanje rastlinskih patogenih bakterij preko razvoja novih metod, pristopov potrjevanja prisotnosti, preučevanja raznolikosti bakterija in njihovih epidemioloških vidikov, pomembnih za sledenje njihove prisotnosti. Testi kvantitativne qPCR, ki smo jih razvili, so vključeni v diagnostične protokole Evropske in mediteranske organizacije za varstvo rastlin (EPPO). Med njimi sta testa za odkrivanje počasi rastočega patogena vinske trte, Xylophilus ampelinus, prvi test s qPCR, ki je bil kadarkoli vključen v smernice EPPO in test qPCR za detekcijo hruševega ožiga v simptomatskih in latentno okuženih vzorcih (povzročitelj Erwinia amylovora). Zanima nas izboljšanje zanesljivosti in analitične občutljivosti odkrivanja bakterij Ralstonia solanacearum in Erwinia amylovora z metodo digitalne PCR. Prav tako se ukvarjamo z detekcijo Xylella fastidiosa in ostalih bakterij iz družine Xanthomonadaceae v semenih. Pred kratkim smo razvili izotermalni test (LAMP) za odkrivanje Ralstonia solanacearum in E. coli, patogene za ljudi in ptice. Poleg vsega naštetega, se ukvarjamo še s sekvenciranjem in analizo genomov potencialno nove vrste bakterij Dickeya sp., ki povzroča mehke gnilobe orhidej, in litičnega bakteriofaga teh bakterij. Proučujemo tudi interakcijo med bakteriofagi in bakterijami, saj je eden izmed ciljev raziskav uporaba bakteriofagov kot biološko sredstvo za boj proti bakterijskim boleznim rastlin.

 

Fitoplazme

Naše raziskave fitoplazem so osredotočene na njihovo epidemiologijo. Proučujemo variabilnost sevov in njihovo pojavljanje v gostiteljskih rastlinah in žuželkah, pomembnih za prenos fitoplazem. Raziskujemo vrste fitoplazem, ki okužujejo sadno drevje (npr.: ‘Candidatus Phytoplasma mali’, ‘Ca. P. pyri’ and ‘Ca. P. prunorum’) in fitoplazme, povzročiteljice trsnih rumenic (npr.: ‘Ca. P. solani’, povzročiteljica počrnelosti lesa - Bois Noir in fitoplazma FDp, povzročiteljica zlate trsne rumenice - Flavescence dorée). Razvili smo različne metode za detekcijo fitoplazem. Skupaj z izolacijo DNA z magnetnimi kroglicami naši testi qPCR omogočajo visoko specifičnost in občutljivost, ter hitro analizo večjega števila vzorcev hkrati. Test qPCR za detekcijo FDp smo uspešno prenesli na metodo digitalne PCR in s tem omogočili enostavnejše kvantitativne meritve. Za hitrejšo in enostavnejšo detekcijo fitoplazem na terenu smo razvili tudi izotermalni test LAMP. Tako test qPCR kot tudi LAMP sta vključena v diagnostične protokole evropske in mediteranske organizacije za varstvo rastlin (EPPO).

 

Virusi

V viroloških raziskavah raziskujemo predvsem rastlinske viruse (PVY, PepMV, GFLV…), ki so škodljivci na ekonomsko pomembnih rastlinah, kot so krompir, paradižnik in vinska trta. Proučujemo razporeditev in gibanje virusov po rastlini (GFP PVY), spremembe, ki jih povzroča virusna infekcija, genetsko raznolikost virusov in biološki pomen te raznolikosti. Raziskujemo tudi raznolikost virusnih populacij, še posebej nas zanima struktura in dinamika virusnih populacij znotraj rastlin (s pomočjo NGS in modelnega virusa PVY). Metodo NGS uporabljamo tudi za iskanje novih virusov v vzorcih iz okolja. V zadnjih nekaj letih smo naše raziskave na virusih razširili na viruse, ki se prenašajo preko kroženja vode v okolju (rastlinski – PepMV in humani – rotavirus, norovirus, sapovirus, astrovirus). Razvili in izpopolnili smo metode za koncentriranje, detekcijo, kvantifikacijo in odstranjevanje virusov iz vod.




Zbirka bakterij, virusov in viroidov

Referenčni in drugi kontrolni materiali so bistvenega pomena pri diagnostiki in pri raziskovalnem delu. Na področju rastlinske patologije certificirani referenčni materiali znane sestave in koncentracije za posamezni tarčni organizem niso na voljo. Večina kontrol, ki jih uporabljamo pri našem delu smo zato pripravili sami, npr. pozitivne kontrole za ekstrakcijo DNA, ki vsebujejo znano koncentracijo tarčnega organizma v rastlinskem materialu. Kontrole se uporabljajo za preverjanje in potrjevanja pravilne izvedbe testov in poskusov (njihova specifičnost, občutljivost in robustnost), ter pri razvoju in validaciji metod. Od leta 1990 v ta namen, po smernicah Svetovne federacije za zbirke bakterijskih kultur (World Federation for Culture Collections), hranimo delovno zbirko bakterij v sistemu Microbank (Pro-Lab Diagnostics). V rastlinskih tkivnih kulturah ali v okuženih rastlinah v karantenskem rastlinjaku pa ohranjamo tudi zbirko fitoplazem in virusov, ki jih ni mogoče gojiti samostojno v gojiščih. Nekatere viruse in viroide hranimo zamrznjene v liofiliziranem rastlinskem materialu. Celotna zbirka obsega 359 izolatov virusov, viroidov ali fitoplazem in več kot 2000 izolatov bakterij, vključno z (i) referenčnimi izolati posameznih rastlinskih patogenov, (ii) izolatov, ki lahko navzkrižno reagirajo s testi za določanje rastlinskih patogenov, (iii ) izolatov, ki predstavljajo mikrofloro gostiteljskih rastlin, in (iv) izolatov škodljivih organizmov, ki smo jih izolirali iz vzorcev na Nacionalnem inštitutu za biologijo. Zadnja skupina izolatov je ključnega pomena za uvajanje in razvoj novih metod, saj se izolati prisotni v Sloveniji lahko razlikujejo od izolatov, ki se uporabljajo pri pripravi splošnih testov. Posledično taki testi niso vedno primerni za analizo lokalnih vzorcev. Slovenski izolati so že bili uporabljeni za izboljšanje obstoječih metod in razvoj metod za sledenje izvora in za filogenetske analize rastlinskih patogenov.

Izbrane objave

Znanstveni članki:

 

  • DULAR, Matevž, GRIESSLER BULC, Tjaša, GUTIÉRREZ-AGUIRRE, Ion, HEATH, Ester, KOSJEK, Tina, KRIVOGRAD-KLEMENČIČ, Aleksandra, ODER, Martina, PETKOVŠEK, Martin, RAČKI, Nejc, RAVNIKAR, Maja, ŠARC, Andrej, ŠIROK, Brane, ZUPANC, Mojca, ŽITNIK, Miha, KOMPARE, Boris. Use of hydrodynamic cavitation in (waste)water treatment. Ultrasonics Sonochemistry, ISSN 1350-4177, 2016, vol. 29, str. 577-588, doi: 10.1016/j.ultsonch.2015.10.010.
  • RAČKI, Nejc, KRAMBERGER, Petra, STEYER, Andrej, GAŠPERŠIČ, Jernej, ŠTRANCAR, Aleš, RAVNIKAR, Maja, GUTIÉRREZ-AGUIRRE, Ion. Methacrylate monolith chromatography as a tool for waterborne virus removal. Journal of chromatography. A, ISSN 0021-9673, 2015, vol. 1381, str. 118-124, doi: 10.1016/j.chroma.2015.01.003.
  • RUŠČIĆ, Jelena, GUTIÉRREZ-AGUIRRE, Ion, TUŠEK-ŽNIDARIČ, Magda, KOLUNDŽIJA, S., SLANA, A., BARUT, Miloš, RAVNIKAR, Maja, KRAJAČIĆ, Mladen. A new application of monolithic supports: the separation of viruses from one another. Journal of chromatography. A, ISSN 0021-9673, 2015, vol. 1388, str. 69-78, doi: 10.1016/j.chroma.2015.01.097.
  • KUTNJAK, Denis, RUPAR, Matevž, GUTIÉRREZ-AGUIRRE, Ion, CURK, Tomaž, KREUZE, Jan F., RAVNIKAR, Maja. Deep sequencing of virus derived small interfering RNAs and RNA from viral particles shows highly similar mutational landscape of a plant virus population. Journal of virology, ISSN 0022-538X, 2015, vol. 89, no. 9, str. 4760-4769, doi: 10.1128/JVI.03685-14.
  • RUPAR, Matevž, FAUREZ, Florence, TRIBODET, Michel, GUTIÉRREZ-AGUIRRE, Ion, DELAUNAY, Agnes, GLAIS, Laurent, KRIŽNIK, Maja, DOBNIK, David, GRUDEN, Kristina, JACQUOT, Emmanuel, RAVNIKAR, Maja. Fluorescently tagged Potato virus Y: a versatile tool for functional analysis of plant-virus interactions. Molecular plant-microbe interactions, ISSN 0894-0282, 2015, vol. 28, no. 7, str. 739-750, doi: 10.1094/MPMI-07-14-0218-TA.
  • KOGOVŠEK, Polona, HODGETTS, Jennifer, HALL, J., PREZELJ, Nina, NIKOLIĆ, Petra, MEHLE, Nataša, LENARČIČ, Rok, ROTTER, Ana, DICKINSON, M., BOONHAM, Neil, DERMASTIA, Marina, RAVNIKAR, Maja. LAMP assay and rapid sample preparation method for on-site detection of flavescence dorée phytoplasma in grapevine. Plant Pathology, ISSN 0032-0862, 2015, vol. 64, no. 2, str. 286-296. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/ppa.12266/abstract;jsessionid=7850B082A5DCFD15057B22A9A431AFE1.f03t02, doi: 10.1111/ppa.12266.
  • RAČKI, Nejc, MORISSET, Dany, GUTIÉRREZ-AGUIRRE, Ion, RAVNIKAR, Maja. One-step RT-droplet digital PCR: a breakthrough in the quantification of waterborne RNA viruses. Analytical and bioanalytical chemistry, ISSN 1618-2642, 2014, vol. 406, issue 3, str. 661-667. doi: 10.1007/s00216-013-7476-y.
  • DREO, Tanja, PIRC, Manca, RAMŠAK, Živa, PAVŠIČ, Jernej, MILAVEC, Mojca, ŽEL, Jana, GRUDEN, Kristina. Optimising droplet digital PCR analysis approaches for detection and quantification of bacteria: a case study of fire blight and potato brown rot. Analytical and bioanalytical chemistry, ISSN 1618-2642, 2014, vol. 406, issue 26, str. 6513-6528, doi: 10.1007/s00216-014-8084-1.
  • GUTIÉRREZ-AGUIRRE, Ion, HODNIK, Vesna, GLAIS, Laurent, RUPAR, Matevž, JACQUOT, Emmanuel, ANDERLUH, Gregor, RAVNIKAR, Maja. Surface plasmon resonance for monitoring the interaction of Potato virus Y with monoclonal antibodies. Analytical biochemistry, ISSN 0003-2697, 2014, vol. 447, str. 74-81. doi: 10.1016/j.ab.2013.10.032.
  • MEHLE, Nataša, GUTIÉRREZ-AGUIRRE, Ion, PREZELJ, Nina, DELIĆ, Duška, VIDIC, Urška, RAVNIKAR, Maja. Survival and transmission of Potato virus Y, Pepino mosaic virus, and Potato spindle tuber viroid in water. Applied and environmental microbiology, ISSN 0099-2240, 2014, vol. 80, no. 4, str. 1455-1462. doi: 10.1128/AEM.03349-13.
  • MEHLE, Nataša, DREO, Tanja, JEFFRIES, C., RAVNIKAR, Maja. Descriptive assessment of uncertainties of qualitative real-time PCR for detection of plant pathogens and quality performance monitoring. Bulletin OEPP, ISSN 0250-8052, 2014, vol. 44, no. 3, str. 502-509, doi: 10.1111/epp.12166.
  • BÜHLMANN, Andreas, DREO, Tanja, REZZONICO, Fabio, POTHIER, Joël F., SMITS, T., RAVNIKAR, Maja, FREY, J., DUFFY, Brion. Phylogeography and population structure of the biologically invasive phytopathogen Erwinia amylovora inferred using minisatellites. Environmental microbiology, ISSN 1462-2912. [Print ed.], 2014, vol. 16, issue 7, str. 2112-2125. http://dx.doi.org/10.1111/1462-2920.12289, doi: 10.1111/1462-2920.12289.
  • RAČKI, Nejc, DREO, Tanja, GUTIÉRREZ-AGUIRRE, Ion, BLEJEC, Andrej, RAVNIKAR, Maja. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant methods, ISSN 1746-4811, Dec. 2014, vol. 10, str. 1-20, doi: 10.1186/s13007-014-0042-6.
  • LENARČIČ, Rok, MORISSET, Dany, PIRC, Manca, LLOP, Pablo, RAVNIKAR, Maja, DREO, Tanja. Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum. PloS one, ISSN 1932-6203, Apr. 2014, vol. 9, iss. 4, str. 1-8, ilustr., doi: 10.1371/journal.pone.0096027.
  • KUTNJAK, Denis, SILVESTRE, Rocio, CUELLAR, Wilmer J., PEREZ, Wilmer, MÜLLER, Giovanna, RAVNIKAR, Maja, KREUZE, Jan F. Complete genome sequences of new divergent potato virus X isolates and discrimination between strains in a mixed infection using small RNAs sequencing approach. Virus Research, ISSN 0168-1702. [Print ed.], 2014, vol. 191, str. 45-50. http://dx.doi.org/10.1016/j.virusres.2014.07.012, doi: 10.1016/j.virusres.2014.07.012.
  • STEYER, Andrej, GUTIÉRREZ-AGUIRRE, Ion, KOLENC, Marko, KOREN, Simon, KUTNJAK, Denis, POKORN, Marko, POLJŠAK-PRIJATELJ, Mateja, RAČKI, Nejc, RAVNIKAR, Maja, SAGADIN, Martin, FRATNIK STEYER, Adela, TOPLAK, Nataša. High similarity of novel orthoreovirus detected in a child hospitalized with acute gastroenteritis to mammalian orthoreoviruses found in bats in Europe. Journal of clinical microbiology, ISSN 0095-1137, 2013, vol. 51, no. 11, str. 3818-3825, doi: 10.1128/JCM.01531-13.
  • PREZELJ, Nina, NIKOLIĆ, Petra, GRUDEN, Kristina, RAVNIKAR, Maja, DERMASTIA, Marina. Spatiotemporal distribution of flavescence dorée phytoplasma in grapevine. Plant Pathology, ISSN 0032-0862, 2013, vol. 62, no. 4, str. 760-766. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-3059.2012.02693.x/pdf, doi: 10.1111/j.1365-3059.2012.02693.x.
  • LENARČIČ, Rok, MORISSET, Dany, MEHLE, Nataša, RAVNIKAR, Maja. Fast real-time detection of Potato spindle tuber viroid by RT-LAMP. Plant Pathology, ISSN 0032-0862, 2013, vol. 62, issue 5, str. 1147-1156, doi: 10.1111/ppa.12017.
  • RUPAR, Matevž, RAVNIKAR, Maja, TUŠEK-ŽNIDARIČ, Magda, KRAMBERGER, Petra, GLAIS, Laurent, GUTIÉRREZ-AGUIRRE, Ion. Fast purification of the filamentous Potato virus Y using monolithic chromatographic supports. Journal of chromatography. A, ISSN 0021-9673, 2013, vol. 1272, str. 33-40, doi: 10.1016/j.chroma.2012.11.058.
  • DREO, Tanja, PIRC, Manca, RAVNIKAR, Maja. Real-time PCR, a method fit for detection and quantification of Erwinia amylovora. Trees, ISSN 0931-1890, 2012, vol. 26, no. 1, str. 165-178. http://dx.doi.org/10.1007/s00468-011-0654-7, doi: 10.1007/s00468-011-0654-7.
  • KOGOVŠEK, Polona, KLADNIK, Aleš, MLAKAR, Jana, TUŠEK-ŽNIDARIČ, Magda, DERMASTIA, Marina, RAVNIKAR, Maja, POMPE NOVAK, Maruša. Distribution of Potato virus Y in potato plant organs, tissues and cells. Phytopathology, ISSN 0031-949X. [Print ed.], 2011, vol. 101, no. 11, str. 1292-1300. http://dx.doi.org/10.1094/PHYTO-01-11-0020, doi: 10.1094/PHYTO-01-11-0020.
  • GUTIÉRREZ-AGUIRRE, Ion, STEYER, Andrej, BANJAC, Marko, KRAMBERGER, Petra, POLJŠAK-PRIJATELJ, Mateja, RAVNIKAR, Maja. On-site reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction detection of rotaviruses concentrated from environmental water samples using methacrylate monolithic supports. In: GIESE, R. (edit.). Selected Papers of the 4th Summer School of Monolith Technology for Biochromatography, Bioconversion and Phase State Synthesis, Portorož, Slovenia, 30 May-02 June 2010, (Journal of Chromatography A, ISSN 0021-9673, Vol. 1218, no 17 (2011)). [S. l.]: Elsevier, cop. 2011, vol. 1218, no. 17, str. 2368-2373. doi: 10.1016/j.chroma.2010.10.048.
  • HANSSEN, Inge M., RAVNIKAR, Maja, et al. Seed transmission of Pepino mosaic virus in tomato. European journal of plant pathology, ISSN 0929-1873, 2010, vol. 126, no. 2, str. 145-152. http://dx.doi.org/10.1007/s10658-009-9528-x, doi: 10.1007/s10658-009-9528-x.
  • NIKOLIĆ, Petra, MEHLE, Nataša, GRUDEN, Kristina, RAVNIKAR, Maja, DERMASTIA, Marina. A panel of real-time PCR assays for specific detection of three phytoplasmas from the apple proliferation group. Molecular and cellular probes, ISSN 0890-8508, 2010, vol. 24, issue 5, str. 303-309. http://dx.doi.org/10.1016/j.mcp.2010.06.005, doi: 10.1016/j.mcp.2010.06.005.
  • HANSSEN, Inge M., GUTIÉRREZ-AGUIRRE, Ion, PAELEMAN, A., GOEN, K., WITTEMANS, L., LIEVENS, B., VANACHTER, A. C. R. C., RAVNIKAR, Maja, THOMMA, B. P. H. J. Cross-protection or enhanced symptom display in greenhouse tomato co-infected with different Pepino mosaic virus isolates. Plant Pathology, ISSN 0032-0862, 2010, vol. 59, no. 1, str. 13-21. http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-3059.2009.02190.x, doi: 10.1111/j.1365-3059.2009.02190.x.

Pregledni znanstveni članki in poglavja monografij:
    • ERJAVEC, Jana, KOS, Janko, RAVNIKAR, Maja, DREO, Tanja, SABOTIČ, Jerica. Proteins of higher fungi - from forest to application. Trends in biotechnology, ISSN 0167-7799. [Print ed.], 2012, vol. 30, issue 5, str. 259-273. http://dx.doi.org/10.1016/j.tibtech.2012.01.004, doi: 10.1016/j.tibtech.2012.01.004.
    • MEHLE, Nataša, RAVNIKAR, Maja. Plant viruses in aqueous environment: survival, water mediated transmission and detection. Water research, ISSN 0043-1354. [Print ed.], 2012, vol. 46, iss. 16, str. 4902-4917. http://dx.doi.org/10.1016/j.watres.2012.07.027, doi: 10.1016/j.watres.2012.07.027.
    • GUTIÉRREZ-AGUIRRE, Ion, RAČKI, Nejc, DREO, Tanja, RAVNIKAR, Maja. Droplet digital PCR for absolute quantification of pathogens. In: LACOMME, Christophe (edit.). Plant pathology: techniques and protocols, (Methods in molecular biology, ISSN 1064-3745, 1302). 2nd ed. New York: Humana Press, cop. 2015, str. 331-347, doi: 10.1007/978-1-4939-2620-6_24.
    • MEHLE, Nataša, NIKOLIĆ, Petra, RUPAR, Matevž, BOBEN, Jana, RAVNIKAR, Maja, DERMASTIA, Marina. Automated DNA extraction for large numbers of plant samples. In: DICKINSON, Matthew (edit.), HODGETTS, Jennifer (edit.). Phytoplasma: methods and protocols, (Methods in Molecular Biology, ISSN 1064-3745, vol. 938), (Springer Protocols). New York: Humana Press, 2013, str. 139-145. http://www.springer.com/us/book/9781627030885#
    • MEHLE, Nataša, PREZELJ, Nina, HREN, Matjaž, BOBEN, Jana, GRUDEN, Kristina, RAVNIKAR, Maja, DERMASTIA, Marina. A real-time PCR detection system for the bois noir and flavescence dorée phytoplasmas and quantification of the target DNA. In: DICKINSON, Matthew (edit.), HODGETTS, Jennifer (edit.). Phytoplasma: methods and protocols, (Methods in Molecular Biology, ISSN 1064-3745, vol. 938), (Springer Protocols). New York: Humana Press, 2013, str. 253-268. http://www.springer.com/us/book/9781627030885#
    • PIRC, Manca, RAVNIKAR, Maja, DREO, Tanja. Assesing DNA extraction methods for real-time PCR detection of quarantine plant pathogenic bacteria. In: ZHOU, Chunxu (edit.), LING, Xia (edit.). DNA binding and DNA extraction: methods, applications and limitations, (DNA and RNA). New York: Nova Biomedical, cop. 2011, str. 205-225. https://www.novapublishers.com/catalog/product_info.php?products_id=28239