Projekti

Napredni 3D celični modeli: Premostitev vrzeli med in vitro in in vivo poskusnimi sistemi (hep3DGenTox)

Koordinator projekta: izr. prof. Bojana Žegura

Oznaka: J1-2465

Trajanje: 1.9.2020―31.8.2023

Temeljni raziskovalni projekt J1-2465 financira Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije iz državnega proračuna.

Raziskovalna skupina - link to database SICRIS
Informacije o projektu: link to database SICRIS

Povzetek:
V skladu z veljavno zakonodajo je testiranje genotoksičnosti obvezno za nove kemikalije in izdelke, kot so zdravila, kozmetika, dodatki k prehrani, pesticidi itd. Mednarodni predpisi v prvi fazi testiranja genotoksičnosti zahtevajo baterijo in vitro testov na bakterijah in sesalčjih celicah, čemur v primeru pozitivnih rezultatov nujno sledijo poskusi in vivo. V skladu s predlagano strategijo Referenčnega laboratorija Evropske unije za alternative poskusom na živalih (EURL ECVAM) je "Preprečevanje in zmanjševanje uporabe živali v genotoksikologiji" mogoče doseči z izboljšanjem izvedbe in vitro testne baterije ali z razvojem izboljšanih in vitro poskusnih modelov, ki bi jim sledilo manj in vivo preverjanj.

Ocenjuje se, da je trenutno 80% vseh izvedenih in vitro testiranj genotoksičnosti v EU lažno pozitivnih in posledično se žrtvuje visoko število poskusnih živali, čemur bi se lahko izognili z bolj zanesljivimi testnimi sistemi. Pomemben razlog za lažno pozitivne rezultate dobljene z obstoječimi dvodimenzionalnimi (2D) in vitro celičnimi modeli je, da le-ti ne izražajo vseh metabolnih encimov I in II faze, ki katalizirajo metabolno aktivacijo in detoksifikacijo genotoksinov. Zaradi tega je nujno potrebno razviti izboljšane in vitro celične sisteme, ki bodo bolj realno posnemali vedenje celic in vivo in zagotovili bolj napovedne rezultate za pogoje in vivo. V tem oziru so tridimenzionalne (3D) celične kulture zaradi izboljšanih interakcij celica-celica in celica-matriks ter ohranjenih kompleksnih celičnih fenotipov in vivo pridobile na vse večjem zanimanju. Poleg tega jetrni 3D celični modeli izkazujejo višjo raven jetrno specifični funkcij vključno z metabolnimi encimi v primerjavi z 2D modeli. Vendar pa kljub očitnim prednostim 3D modelov v primerjavi z 2D modeli, le-ti doslej še niso bili razviti in uporabljeni za testiranje genotoksičnosti. Tako je namen hep3DGenTox razviti napredne fiziološko bolj relevantne človeške 3D in vitro celične modele z izboljšanimi jetrnimi značilnostmi in povečano metabolno kapaciteto. V projektu bomo razvili sferoide iz človeških jetrnih celičnih linij pri statičnih (prisilna plavajoča metoda) in dinamičnih (bioreaktorji) pogojih kot tudi na bio-tiskanih nosilcih pripravljenih iz različnih biokompatibilnih materialov. Najobetavnejše novo razvite 3D in vitro celične modele bomo okarakterizirali (celična rast, izražanje metabolnih encimov I in II faze na nivoju genov in proteinov) in jih validirali za testiranje genotoksičnosti s pomočjo kemikalij s seznama EURL ECVAM, ki ga je v ta namen sestavila skupina strokovnjakov, ki se ukvarja z z validacijo novih in vitro genotoksikoloških testov. Pričakujemo, da bo z novo razvitimi jetrnimi 3D celičnimi modeli moč doseči zanesljivejše rezultate (tj. manj lažno pozitivni). Zaradi tega bo njihova uporaba pri testiranju genotoksičnosti pomembno prispevala k zmanjšanju uporabe laboratorijskih glodavcev in bolj zanesljivi oceni tveganja kemikalij in izdelkov, kar je ključno za varovanje zdravja ljudi. Poleg tega bodo napredni 3D in vitro celični modeli uporabni za študije akutne in kronične toksičnosti.




Cilji projekta
Glavni cilj hep3DGenTox projekta je razviti napredne za človeka fiziološko bolj relevantne 3D in vitro celične modele z izboljšanimi jetrnimi značilnostmi in povečano metabolno kapaciteto, ki bodo bolje odražali pogoje in vivo. Novo razviti 3D modeli bodo predstavljali obetavno orodje za pridobivanje bolj napovednih podatkov genotoksičnega delovanja različnih spojin za človekovo izpostavitev, kar bo pospešilo predkliničen razvoj novih zdravil, ki bod tako imeli boljši profil varnosti in učinkovitosti.


Posebni cilji projekta hep3DGenTox so:
•    Razviti izboljšane za človeka fiziološko bolj relevantne 3D in vitro celične modele z izboljšanimi jetrnimi funkcijami;
•    Optimizirati nove jetrne 3D in vitro celične modele specifično za oceno genotoksičnosti, kar je pomembno za regulatorne namene;
•    Validirati nove jetrne 3D in vitro celične modele za namen testiranja genotoksičnosti z modelnimi genotoksičnimi spojinami;
•    Identificirati nove bolj napovedne biomarkerje s korelacijo toksikogenomskih podatkov s tradicionalnimi končnimi genotoksičnimi učinki;
•    Zagotoviti 3D in vitro celične modele za proučevanje dolgodobnih učinkov kot so odzivi pri kronični izpostavljenosti nizkim koncentracijam.

Hep3DGenTox projekt predstavlja idealno priložnost za razvoj naprednih fiziološko bolj pomembnih jetrnih 3D in vitro celičnih modelov, ki bodo premostili vrzel med tradicionalnimi 2D celičnimi modeli in vitro in poskusi in vivo v genski toksikologiji.




Pomen za znanost
Ena izmed glavnih težav trenutne strategije regulative za preizkušanje genotoksičnosti kemikalij je visoka stopnja lažno pozitivnih rezultatov, posledica česar so nepotrebne študije in vivo, kar pa povzroča nezaželene posledice za varovanje in dobro počutje živali. Poleg tega so omejitve 2D sistemov in vitro in preskusi na živalih povezani z visokimi stroški nadaljnjega testiranja kot tudi zamude pri trženju izdelkov, kar zahteva razvoj bolj napovednih testov in vitro, ki jih bodo sprejeli tudi regulatorni organi. EU regulatorji in ameriška uprava za hrano in zdravila (FDA) že sedaj menijo, da imajo 3D-celičnih sistemi potencial in predstavljajo zanesljivo možnost. Tako lahko inovativni 3D modeli in vitro izboljšajo predklinično testiranje in s tem pospešijo predklinični razvoj novih zdravil z boljšim profilom varnosti in učinkovitosti. Zato bo pridobljeno novo znanje, pomembno za razvoj 3D modelov in vitro v prihodnosti ter za boljše razumevanje in interpretacijo toksikoloških rezultatov, kar je pomembno za regulativno toksikologijo. Nadalje bo razpoložljivost boljših modelov z metabolično aktivnimi celicami in razvitimi metodološkimi pristopi veljala ne le za rutinsko testiranje, temveč tudi za mehanistične toksikološke študije, zlasti za preiskave nevarnosti zaradi izpostavljenosti mešanicam onesnaževal, kar je trenutno ena najbolj vročih znanstvenih tem na področju toksikologije in ocene tveganja za zdravje ljudi in okolja. Če povzamemo, imajo izboljšani jetrni 3D celični modeli in njihova uporaba za testiranje genotoksičnosti posebne regulatorne in znanstvene vrednosti za oceno varnosti izpostavitve ljudi kemikalijam.
Napredni jetrni 3D celični modeli z izboljšano metabolno zmogljivostjo in dolgodobno stabilnostjo predstavljajo pomemben korak naprej na področju genotoksikologije. Pričakujemo lahko, da bodo napredni 3D celični modeli imeli ključno vlogo pri razvoju zdravil in oceni varnosti kemikalij s cilji: i) izboljšati napovednost za genotoksičnost in potencialno rakotvornost in vivo, ii) podpirati razumevanje mehanizmov s pomočjo "omskih" analiz v bolj fiziološko pomembnem testnem sistemu kot trenutno uporabljenih 2D sistemih, iii) zagotoviti osnovo za oceno varnosti in opredelitev toksikološkega tveganja, in iv) bistveno prispevati k zmanjšanju uporabe živali. Zaradi svojih fizioloških, molekularnih in histoloških fenotipov skupaj z dolgoročno stabilnostjo, so ti modeli deležni vse večje pozornosti s strani akademskega sveta in industrije. Že sedaj nadomeščajo poskuse na živalih na področju razvoja zdravil, vendar bodo zagotovo postali nepogrešljivo orodje tudi pri oceni varnosti in tveganja številnih kemikalij, kar poudarja pomen in pomembnost hep3DGenTox projekta.

Ključne besede: 3D in vitro celični model, genotoksičnost, 3D nosilci, sferoidi