Raziskovalci Oddelka za Biotehnologijo in sistemsko biologijo so v znanstveni reviji Scientific Reports, ki je pod okriljem skupine Nature, objavili nov večtarčni pristop pomnoževanja in kvantifikacije s kapljično digitalno PCR  (ddPCR).

Odkritje termostabilne DNA polimeraze, več kot petdeset let nazaj, je omogočilo razvoj verižnih reakcij s polimerazo (PCR), ki se uporabljajo za molekularno detekcijo na različnih področjih, kot so kontrola hrane, medicina, farmacija, ipd.. V današnjem času se za kvantifikacijo nukleinskih kislin največ uporablja metoda PCR v realnem času (qPCR) vendar se vse bolj uveljavlja tudi uporaba digitalne PCR (dPCR).

Princip dPCR je enostaven: reakcijska mešanica se razdeli na nekaj sto ali milijon delov ozirom particij (bodisi v komore na čipu ali kapljice v oljni emulziji), ki so nato vsi skupaj izpostavljeni PCR reakciji. Na koncu se preko fluorescentnega signala vsako od particij analizira, rezultat pa zabeleži kot število pozitivnih particij glede na število vseh prebranih. Ta vrednost je podlaga za izračun končne absolutne koncentracije tarče na začetku reakcije.

Pri večini kvantitativnih qPCR reakcij, se naenkrat pomnožuje samo eno tarča. Istočasna kvantifikacija več tarč bi tako lahko pomembno izboljšala cenovno učinkovitost analiz. Aparat za ddPCR, dostopen na Oddelku za biotehnologijo in sistemsko biologijo (QX100/200 Digital Droplet PCR System, Bio-Rad) v osnovi omogoča pomnoževanje in zaznavanje dveh tarč hkrati, saj vsebuje dva različna fluorescenčna filtra.

Dobnik in sod. so za ddPCR Bio-Rad QX aparaturo razvili štiri-tarčno metodo, kar do sedaj za omenjeno aparaturo še ni bilo objavljeno. Zaradi kompleksnosti analize so razvili tudi spletno orodje, ki olajša in avtomatizira analizo rezultatov. Kot model so uporabljali gensko spremenjene koruze, za katere so razvili dve štiritarčni metodi, ki pokrivata sedem linij koruz in koruzni endogen.

Predstavljena študija je bila tudi prva, ki je takšen večtarčni pristop tudi obširno karakterizirala preko preverjanja parametrov kot so meja kvantifikacije in detekcije, občutljivost, ponovljivost in specifičnost.

Razvita večtarčna metoda je pokazala na visok potencial uporabe ddPCR za sočasno kvantifikacijo več tarč, obenem pa ideja večtarčnega pomnoževanja ni uporabna le za kvantifikacijo gensko spremenjenih koruz, ampak je prenosljiva tudi na ostala področja, kjer analize zavzemajo kvantifikacijo več tarč hkrati.

 

Članek je prosto dostopen na spodnjem naslovu: