NIB

dr. David Dobnik

Working place: znanstveni sodelavec

Telephone number: 059 23 28 19
Email: david.dobnik@nib.si
Department: Oddelek za biotehnologijo in sistemsko biologijo

Izobrazba:

  • 2002 - 2007 Študij biologije na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani
  • 2007 - 2012 Podiplomski študij bioloških in biotehniških znanosti - smer biotehnologija na  Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani. Zaključil z doktorsko disertacijo z naslovom: Funkcijska analiza genov s transgenimi rastlinami in razvoj nivih metod za določanje gensko spremenjenih organizmov.
  • Od leta 2007 zaposlen na Nacionalnem inštitutu za biologijo.

Izpis bibliografije (COBISS)
Izpis bibliografije (Google Scholar)




Raziskovalno delo

Moje trenutno raziskovalno delo lahko razdelim na tri področja:

  • Kvantifikacija in karakterizacija virusnih vektorjev za gensko zdravljenje
  • Določanje gensko spremenjenih organizmov (GSO)
  • Ostali izzivi


Kvantifikacija in karakterizacija virusnih vektorjev za gensko zdravljenje

Delo na tem področju v večini zajema pogodbeno raziskovanje s podjetji iz Evrope in ZDA, kot je na primer podjetje AveXis

Fokus raziskovalnih aktivnosti je na:

  • Razvoju, uporabi, optimizaciji in validaciji molekularnih metod, kot sta primer kapljična digitalna PCR in PCR v realnem času za kvantifikacijo virusov ter detekcijo/kvantifikacijo rezidualne celične DNA
  • Visoko-zmogljivo sekvenciranje za študije virusne uniformnosti, zaznavanje škodljivih virusov, identifikacijo prisotnih nukleinskih kislin (nečistoč), itd..  
  • Transmisijska elektronska mikroskopija za oceno integritete virusnih kapsid, čistoče vzorca in razmerja polnih in praznih virusov. 


Določanje GSO

Sodelujem pri razvoju novih metod za določanje GSO, s trenutnim poudarkom na digitalni PCR. V sodelovanju z Norveškim veterinarskim inštitutom, smo v okviru evropskega projekta 7. okvirnega programa DECATHLON, razvili nove večtarčne pristope za kvantifikacijo GSO. Nove večtarčne pristope smo smo objavili v treh znanstvenih člankih (koruza, soja, 4-tarčni pristop) in poglavju v knjigi (Digital PCR poglavje).
Kot namestnik vodje določanja GSO sem aktivno vpleten v proces optimizacije diagnostike GSO, ki se rutinsko izvaja na našem oddelku.



Ostali izzivi

  • Ovrednotenje različnih platform za digitalno PCR
  • Dekontaminacija vode z uporabo plazemske tehnologije
  • Kvantifikacija diagnostičnih markerjev v izvencelični DNA 
 



Zgodnje raziskovalno delo

 
Moje zgodnje raziskovalno delo je bilo osredotočeno na razvoj novih (alternativnih) metod za določanje GSO (npr. NAIMA) in na funkcionalno analizo različnih genov, vpletenih v interakcijo krompirja in krompirjevega virusa Y (npr. 1,3-beta-glukanaza). Obe temi sta predstavljali ključni del moje doktorske disertacije. 
Metodo NAIMA smo dalje izboljšali v okviru slovenskega raziskovalnega projekta Q-Finder in evropskega projekta Q_DETECT iz 7. okvirnega programa. Rezultat je bil simultano določanje prisotnih RNA in DNA tarč po večtarčnem izotermalnem pomnoževanju (RNA in DNA NAIMA članek).
Delo na funkcionalni analizi genov se je nadaljevalo z vzpostavitvijo sistema za z virusom inducirano utišanje genov (študija v Solanum venturii), kar je bilo omogočeno z mojim dvomesečnim obiskom laboratorija prof. dr. Visserja na Wageningen University and Research na Nizozemskem. Objavljen sistem pa ne bi bil uspešen brez fluorescentno označenega krompirjevega virusa Y (GFP-PVY članek).



Slike iz laboratorija:


Regeneracija rastlin po transformaciji z Agrobacterium tumefaciens:
regeneracija rastlin


Vse pridobljene transgene linije krompirjev vzdržujemo in množimo v tkivnih kulturah (leva slika). Fiziološke poskuse, kjer rastline okužimo z virusom, pa izvajamo na rastlinah posajenih v zemlji (desna slika):


Poleg spremljanja poteka okužbe v rastlinah s spremenjenim izražanjem genov, nas zanima tudi lokalizacija proteinov, ki so produkt izbranih genov. Hkrati pa želimo spremljati še delovanje promotorjev izbranih genov. Oboje nam omogočajo fluorescentni reporterski proteini.

Lokalizacijo proteinov spremljamo s pomočjo zelenega fluorescentnega proteina (GFP):


Aktivnost promotorja izbranega gena se kaže kot prisotnost zelenega fluorescentnega proteina v citoplazmi celic:


V reviji Življenje in tehnika sem na temo fluorescentnih proteinov objavil članek z naslovom Osvetljevanje notranjosti organizmov. Rumeni fluorescentni protein izražen v celici lista krompirja:


Rdeči fluorescentni protein izražen v celici lista tobaka:


Modri fluorescentni protein izražen v celici lista tobaka: