Projekti

Celokupen namen projekta Indie je vzpostaviti produkcijo indola v bakteriji Corynebacterium glutamicum, kar bi predstavljalo ekološki korak naprej, saj se bi za proizvodnjo porabilo manj energije in nastajalo bi manj okolju neprijaznih odpadkov, pa tudi gojišča se pripravlja iz trajnostnih komponent. Poleg tega bi taka proizvodnja bila tudi bolj ekonomična. Bakterija C. glutamicum je varna za proizvodnjo snovi, ki se nato uporablja kot dodatek v kozmetiki ali hrani, saj sodi med organizme, ki so prepoznani kot GRAS.

Za vzpostavitev produkcije indola v bakteriji smo predvideli več pristopov (slika 1). Želeli smo poiskati učinkovite encime triptanaze (TNA), ki so poznane v bakterijah in ki triptofan (Trp) pretvarjarjo v indol. Alternativno smo iskali encime IGL, ki so v rastlinah odgovorni za proizvodnjo indola in sicer iz prekurzorja Trp , to je molekule indop-3-glicerol fosfata (IGP). Poleg tega smo s pomočjo modela centralnega metabolizma predvideli, kako je potrebno modificirati določene poti, da ima bakterija na voljo dovolj prekurzorjev za sintezo indola, ter temu primerno tudi dopolniti gojišče v katerem bakterijo gojimo. Alternativno pa bi lahko Trp tudi kar direktno dodajali v gojišče. V zadnji fazi projekta je predvidena industrijska proizvodnja, optimizacija ekstrakcije indola iz gojišča je del projekta, ki še poteka (konec projekta je predviden v marcu 2022).

Slika 1: Shematski prikaz aktivnosti v projektu INDIE.

Za iskanje encimov obeh tipov smo v prvem obdobju projekta INDIE vzpostavili uspešen sistem za hitro testiranje encima za produkcijo indola. S pomočjo novih bioinformatskih delotokov smo našli nekaj kandidatov tako encimov TNA iz bakterij kot tudi encimov IGL iz rastlin. V zadnjem letu projekta smo celo ugotovili, da protein TrpA iz bakterije C. glutamicum tudi lahko prevzame funkcijo encimov IGL, če v bakteriji ni na voljo encima TrpB. Vzporedno smo izgradili celokupen model metabolizma bakterije in mu dodali še regulatorno omrežje. Predikcije, pridobljene s pomočjo modela, so vodile modifikacije bakterijskega genoma v smeri produkcije več prekurzorejv, transporta metabolitov v celico in transporta ter sinteze določenih kofaktorjev. Prav tako smo na podlagi teh predikcij tudi primerno modificirali gojišče. Prvo generacijo bakterij, ki je s pomočjo encima TNA lahko sintetiziral indol, smo gojili v 1l bioreaktorjih na dva načina, z dodanim Trp in brez njega. Proizvodnja indola ni bila zadostna, zato smo s pomočjo kombinacije transkriptomike, metabolomike in modeliranja poskušali ugotoviti mehanizme, ki preprečijo visoko produkcijo. Rezultati so pokazali težave pri transportu. Produkcijo indola smo tako dvignili s tem, da smo v gojišče dodajali organsko topilo  katerega se je prerazpoerdilo več kot 80% indola, in na ta način zmanjšali nasičenost sistema z indolom in prišli do ekonomsko sprejemljive produkcije. Sistem za produkcijo in čiščenje v industrijskem merilu se še pripravlja. Vzpostavili smo tudi produkcijo indola s pomočjo encima IGL. Z metabolomiko smo ugotovili, da se poleg indola sintetizira še en stranski produkt. V zadnjem obdobju projekta bomo s pomočjo transkriptomike poskušali ugotoviti njegov izvor.

Sodelovanje med partnerji projekta je bilo zelo uspešno. Prav zdaj smo začeli s prijavo projekta v Horizon Europe HORIZON-CL6-2022-CIRCBIO-02-05 za vzpostavitev delotokov iskanja biotehnološko zanimivih proteinov v naravi, kjer bomo iskali nove encime v različnih organizmih v okolju.

Kratek povzetek doprinosa NIB

 V projektu smo partnerji iz NIBa sodelovali pri treh večjih aktivnostih:

-          V delovnem paketu 2 smo s pomočjo novega bioinformatskega delotoka poiskali kandidate za direktno sintezo indola: s pomočjo pregledovanja literature smo izbrali rastline, ki so sposobne sinteze indola, torej v njih obstaja neka varianta encima IGL. S pomočjo znanih IGLjev smo identificirali motive, ki so nujni za aktivnost proteina in potem skenirali celotne proteome izbranih rastiln za primerne kandidate. Izmed 10 kandidatov, sta se 2 izkazala za aktivna tudi v bakterijah

-          Vodili smo delovni paket 4, ki je bil namenjen iskanju mehanizmov, ki blokirajo optimalno produkcijo indola v bakterijah. Povezali smo transkriptomske podatke bakterij, ki so producirali indol s pomočjo encima TNA, z ali brez dodanega triptofana, z modelom metabolima in regulacije bakterije. Pri tem smo uporabili metode diferencialne analize omrežij. Odkrili smo, da je problematičen transport kar je potem vodilo v dodajanje organskih topil v gojišče in s tem odvajanjem indola iz vodne faze okolja bakterij.

-          Skrbeli smo za upravljanje s podatki v skladu s principi Odprte znanosti in principov FAIR. Za potrebe projekta smo uvedli sistem za upravljanje podatkov v sintezni biologiji. In pripravili zasnovo za zapis opisov poskusov fermentacij. Prav tako smo razvili skripte SeekR, ki omogočajo avtomatsko povezovanje s API FairDomHub-a in hkratni prenos vseh datotek projektnega partnerja v to javno bazo metabpodatkov.

Spletna stran projekta: About INDIE (uni-bielefeld.de)

This project is funded by the ERA CoBioTech programme under the European Union’s Horizon 2020 research and innovation programme framework.