Raziskave na fitoplazmah vinske trte

Na Oddelku za biotehnologijo in sistemsko biologijo smo fitoplazme začeli  raziskovati v devedesetih  letih prejšnjega stoletja. V začetku je bilo naše delo usmerjeno predvsem v postavitev molekularnih detekcijskih metod za potrebe fitosanitarnega nadzora trsnih rumenic, to je bolezni, ki jih fitoplazme povzročajo na vinski trti. Na Oddelku za biotehnologijo in sistemsko biologijo smo fitoplazme začeli  raziskovati v devedesetih  letih prejšnjega stoletja. V začetku je bilo naše delo usmerjeno predvsem v postavitev molekularnih detekcijskih metod za potrebe fitosanitarnega nadzora trsnih rumenic, to je bolezni, ki jih fitoplazme povzročajo na vinski trti. (Seljak in sod., 2000, Petrovič in sod., 2004) Kasneje smo razvili tudi metode za detekcijo fitoplazem, ki okužujejo sadno drevje, predvsem koščičarje in pečkarje. Naši sistemi detekcije so v začetku temeljili na uporabi klasičnih PCR reakcij in RFLP (restriction fragment length polymorphysm), danes pa jih zamenjujemo z uporabo kvantitativnega PCR v realnem času (real-time PCR). Skupaj s Fitosanitarno upravo RS in fitosanitarnimi inšpektorji smo vzpostavili mrežo za vzorčenje rastlinskega materiala na terenu. Poleg laboratorijskega dela veliko energije vlagamo v izobraževanje  sodelavcev v laboratoriju kot tudi inšpektorjev, ki vzorčijo rastlinski material na terenu. Že zelo kmalu se je pokazalo, da so pristopi k zatiranju fitoplazem lahko učinkoviti le ob dobrem poznavanju teh patogenih organizmov in njihovih interakcij z gostiteljskimi rastlinami.

Fitoplazme

Fitoplazme so bakterijski patogeni brez celične stene, uvrščeni v razred Mollicutes, ki po vsem svetu povzročajo preko 1000 rastlinskih bolezni. V rastlini naseljujejo s hranili bogato floemsko tkivo. Kolonizacija rastline s fitoplazmami je odvisna od letnega časa, organa, gostiteljske rastline in samega povzročitelja bolezni. Posledično fitoplazme povzročajo različna bolezenska znamenja, ki so odvisna od interference z gostiteljevo fiziologijo. Obligatni prenašalci fitoplazem so žuželke iz reda Hemiptera, ki se hranijo s floemskim sokom. V evoluciji fitoplazem je prišlo do izjemno velikih genomskih sprememb, ki bi lahko prispevale k njihovi veliki odvisnosti od rastlinskih in žuželčjih gostiteljev. Ker je za enkrat gojenje fitoplazem v kulturi neuspešno, so slabo raziskane in njihove fiziološke in genetske lastnosti le slabo razumemo.

Najbolj razširjeni fitoplazmi na vinski trti v Evropi in nasploh v svetu sta fitoplazma, ki povzroča bolezen počrnelost lesa vinske trte (Bois noir, BN) in fitoplazma, ki povzroča bolezen zlato trsno rumenico (Flavescence dorée, FD). Z enotnim izrazom »trsne rumenice« (angl. grapewine yellows) imenujemo kompleks bolezni, ki jih povzročata obe prej omenjeni ter še nekatere druge fitoplazme. Fitoplazma 'bois noir' je razširjena povsod po svetu in je prisotna v vinogradih vseh slovenskih vinorodnih dežel. Prepoznamo jo po značilnih simptomih kot so rumenenje listov (rdečenje pri rdečih sortah), ukrivljanje listnih lamin navzdol, krhkosti listov, odpadanje cvetov in venenju jagod (Slike 1-3). Posledično se zmanjša količina pridelka.

                               

Slika 1: Simptomi trsnih rumenic (rumenenje in zavijanje listov navzdol).

Slika 2: Simptomi trsnih rumenic (rumenenje in zavijanje listov navzdol).

Slika 3: Simptomi trsnih rumenic (sušenje grozdnih jagod).

Raziskave fitoplazemskih bolezni  na Oddelku za biotehnologijo in sistemsko biologijo

Prve temeljne raziskave patogeneze fitoplazem segajo v konec devetdesetih let, ko smo raziskovali interakcijo med fitoplazmo iz skupine 16SrI-B, ki povzroča grmičasto pritlikavost koruze.

Kasneje smo si za modelni raziskovalni objekt izbrali vinsko trto sorte Chardonnay, okuženo s fitoplazmo, ki povzroča počrnelost lesa vinske trte iz skupine stolbur/16SrXII. Zelo pogumno smo se omenjene interakcije lotili z najmodernejšimi metodami za preučevanje izražanja genov, z namenom, da razsvetlimo dogajanje v vinski trti po okužbi s fitoplazmami. Želeli smo pridobiti biološko relevantne podatke, zato se nismo zadovoljili z izvajanjem poskusov v skrbno nadzorovanih laboratorijskih razmerah, temveč smo si za preučevanje izbrali produkcijski vinograd v vasici Vipolže v Goriških Brdih. Takšnih poskusov v znanosti ni zelo veliko, saj naravne razmere lahko zabrišejo tiste spremembe, ki jih želimo podrobneje spremljati. Vendar smo bili pripravljeni sprejeti izziv. Pri tem nam je na pomoč priskočila Vinska klet »Goriška Brda« Dobrovo s svojo svetovalno službo, saj so nam prijazno dovolil uporabo vinograda enega izmed njihovih kooperantov in nam s tem privarčevali veliko časa in energije (Slika 4). Mi pa smo se pri preučevanju omejili na listne žile, tako da nismo pustili veliko škode na grozdnih jagodah (Slika 5).

Slika 4: V vinogradu smo od leta 2004 naprej spremljali iste rastline vinske trte, ki smo si jih zaradi lažjega dela označili.

Slika 5: Izrezovanje listnih žil na terenu. Takoj, ko so žile izrezane jih shranimo v tekočem dušiku.

Prvi korak k proučevanju je bila zelo natančna določitev prisotnosti fitoplazem v posameznem vzorcu vinske trte. Klasični pristopi s PCR niso bili več primerni zaradi slabše občutljivosti, velike količine potrebnega rastlinskega materiala in zaradi dolgotrajnega postopka analize smo razvili novo, hitro in bolj občutljivo metodo za detekcijo fitoplazem trsnih rumenic, ki temelji na metodi PCR v realnem času (Hren s sod., 2007). Metodo smo vpeljali v laboratorij, tako da smo jo na vzorcih iz celotne rastne sezone primerjali z obstoječimi metodami. Z vzpostavitvijo celotnega detekcijskega sistema je nova metoda postopno nadomestila predhodne. Zdaj je v Sloveniji to glavna detekcijska metoda za določevanje fitoplazem, ki povzročajo počrnelost lesa in zlato trsno rumenico.
Spremljanje odziva rastline na okužbo s fitoplazmami nam je omogočila tehnologija DNA-mikromrež. Z mikromrežami smo spremljali izražanje 14.500 genov vinske trte v listnih žilah, ki so tehtale skupaj le desetinko grama. Omenjeno tehnologijo smo uvedli v našo skupino v sodelovanju z inštitutom INRA (L'Institut national de la recherche agronomique) iz Montpellierja v Franciji .

Postavili smo eksperimentalni načrt (Slika 6), v katerem smo v vzorcih rastlin, ki so kazale bolezenska znamenja, in tistih, ki so bile brez znamenj, s kvantitativnim PCR v realnem času najprej preverili prisotnost treh markerskih genov (Hren s sod., 2009a). Na osnovi dobljenih rezultatov smo vzorce nato analizirali še z DNA-mikromrežami (Slika 7).

Slika 6: Eksperimentalni načrt preučevanja izražanja genov v vinski trti z DNA-mikromrežami in PCR v realnem času.

Slika 7: Korak v obdelavi DNA-mikromrež (ekstrakcija podatkov iz slike).

Nepregledno količino podatkov v razpredelnici s 14.500 vrsticami in več deset stolpci, ki jo dajo DNA-mikromreže, smo morali pretvoriti v obliko, ki je za človeško oko in razum enostavnejša. Za dosego tega cilja smo stopili v stik z nemško bioinformatsko skupino na Max Planck inštitutu (Nemčija). Skupaj smo njihov program »MapMan« za vizualizacijo podatkov o izražanju genov v rastlini Arabidopsis thaliana prilagodili za vinsko trto (Vitis vinifera). Velik bioinformatski napor se je poplačal z objavo v ugledni znanstveni reviji BMC Plant Biology, kjer je članek zelo bran ("Highly accessed") (Rotter s sod., 2009, Slika 8).

Slika 8: MapMan je program, ki nam shematsko prikaže metabolne poti in procese v rastlini in na shemah prikaže eksperimentalno izmerjene podatke o izražanju genov, ki pripadajo določenemu procesu. Na tak način enostavno in hitro dobimo pregled kaj se dogaja z metabolnimi potmi v celotni rastlini npr. po okužbi s fitoplazmami. Tu sta prikazani sliki fotosinteze in biotskega stresa. Vsak kvadratek predstavlja en gen, katerega izražanje je zakodirano z barvo (rumena barva pomeni, da je bil gen izražen močneje v okuženi rastlini, modra pa, da je bil močneje izražen v zdravi rastlini).

Tehnologija DNA-mikromrež omogoča spremljanje izražanja velikega števila genov hkrati, vendar pa je manj občutljiva kot npr. PCR v realnem času. Za potrditev rezultatov iz mikromrež smo zato izbrali nekaj ključnih in najbolj zanimivih genov in njihovo izražanje neodvisno potrdili s PCR v realnem času. Ugotovili smo popolno ujemanje, kar je potrdilo naša pričakovanja in omogočilo, da smo lahko z večjo zanesljivostjo interpretirali rezultate DNA-mikromrež. Na podlagi rezultatov smo postavili model metabolizma ogljikovih hidratov v listnih tkivih vinske trte okužene s fitoplazmami (Slika 9). Z analizo genov s PCR v realnem času pa si utiramo pot k iskanju markerskih genov, ki bodo zanesljivo napovedovali okuženost rastlin tudi pred pojavom značilnih simptomov.

Slika 9: Predvidevamo, da ima fitoplazma 'bois noir' tako kot njena sorodnica (iz iste taksonomske skupine stolbur) gen za zapis saharozne fosforilaze, ki je pomembna pri cepljenju saharoze v glikozo-1-fosfat in fruktozo. Ker je nadaljnja usoda teh dveh sladkorjev še neznana, smo skušali le-to razložiti z modelom. Izražanje genov je barvno zakodirano, pri čemer rumena barva pomeni, da je bil gen izražen močneje v okuženi rastlini, modra pa, da je bil močneje izražen v zdravi rastlini. Okrajšave za gene: VvInv2: kisla vakuolarna invertaza; VvSuSy: saharoza sintaza; VvGlc1 in VvGlc2: 1.3-b-glikanaza 1 in 2; VvCaSy: kaloza sintaza; VvAgpL: velika podenota ADP-glukoza pirofosforilaze; Suph: fitoplazemska saharoza fosforilaza.

Omenjeno raziskavo smo objavili v ugledni reviji BMC Genomics (Hren s sod. 2009b). Gre za drugi članek na svetu, ki se je lotil problematike preučevanja fitoplazem na vinski trti z DNA-mikromrežami. Z vsemi objavami na področju raziskav trsnih rumenic smo dosegli na našem Oddelku velik uspeh in si utrli pot v temeljnih raziskavah te bolezni z najnovejšimi metodami molekularne biologije. Dokazali smo, da lahko tudi majhna delovna skupina pomembno prispeva k raziskavam v določenem področju biologije, še posebej če združuje interdisciplinarni pristop (laboratorijski, bioinformatski).

In prihodnost?

Z raziskavami na področju fitoplazem na vinski trti želimo nadaljevati. Preučevanje izražanja genov želimo dopolniti z analizami na drugih nivojih kot so analiza proteinov, encimske aktivnosti in analiza rastlinskih hormonov v vinski trti. Prav tako želimo nadgraditi bioinformatsko analizo v smer analize regulacije izražanja genov (analiza promoterjev). V sodelovanjem z italjansko skupino na Univerzi v Udinah (Biologia e Protezione delle Piante, Universita degli Studi di Udine, Italija) pa želimo z že omenjenim pristopom raziskati zanimiv spontani pojav rezistence na fitoplazme, ali t.i. fenomen ozdravitve (angl. recovery).

Raziskovalci

Na koncu pa moramo predstaviti še tim, ki je na fitoplazmah trsnih rumenic delal od začetka pa do tega trenutka: Nataša Petrovič, Jana Boben, Jernej Brzin, Maja Ravnikar, Kristina Gruden, Matjaž Hren, Petra Nikolič, Marina Dermastia, in Ana Rotter.

Sodelave

• Biologia e Protezione delle Piante, Universita degli Studi di Udine, Italija
• Unité Mixte de Recherche, Sciences Pour l'Œnologie, INRA, Montpellier, Francija
• Laboratoire de Physiologie et Biochimie Végétales, Université de Poitiers, Poitiers, Francija
• Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, Golm, Nemčija
• Department of Genetics and Molecular Biology, IASMA Research Center, Michele a/Adige, Italija
• Vinska klet »Goriška Brda« z.o.o. Dobrovo, Dobrovo, Slovenija
• Kmetijsko gozdarski zavod Nova Gorica, Nova Gorica, Slovenija
• Fitosanitarna uprava Republike Slovenije, Ljubljana, Slovenija

Objave

HREN, Matjaž, BOBEN, Jana, ROTTER, Ana, KRALJ NOVAK, Petra, GRUDEN, Kristina, RAVNIKAR, Maja. Real-time PCR detection systems for Flavescence dorée and Bois noir phytoplasmas in grapevine : comparision with conventional PCR detection and application in diagnostics. Plant Pathol., 2007, vol. 56, str. 785-796. [COBISS.SI-ID 1773135]

HREN, Matjaž, RAVNIKAR, Maja, BRZIN, Jernej, ERMACORA, Paolo, CARRARO, Luigi, BIANCO, P.A., CASATI, P., BORGO, M., ANGELINI, E., ROTTER, Ana, GRUDEN, Kristina. Induced expression of sucrose synthase and alcohol dehydrogenase I genes in phytoplasma-infected grapevine plants grown in the field. Plant Pathol., 2009a, vol. 58, str. 170-180. http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-3059.2008.01904.x, doi: doi:10.1111/j.1365-3059.2008.01904.x. [COBISS.SI-ID 1888335]

HREN, Matjaž, NIKOLIĆ, Petra, ROTTER, Ana, BLEJEC, Andrej, TERRIER, Nancy, RAVNIKAR, Maja, DERMASTIA, Marina, GRUDEN, Kristina. 'Bois noir' phytoplasma induces significant reprogramming of the leaf transcriptome in the field grown grapevine. BMC Genomics, 2009b, vol. 10, no. 460, 38 str. http://www.biomedcentral.com/1471-2164/10/460, doi: 10.1186/1471-2164-10-460. [COBISS.SI-ID 2103375]

PETROVIČ, Nataša, BOBEN, Jana, RAVNIKAR, Maja. Laboratorijsko testiranje trsnih rumenic v Sloveniji kaže na splošno prisotnost rumenice tipa počrnelosti lesa = Laboratory testing of grapevine yellows in Slovenia indicates a widespread presence of Bois noir. Acta agric. Slov.. [Tiskana izd.], 2004, vol. 83, št. 2, str. 313-322. [COBISS.SI-ID 4167545]

ROTTER, Ana, HREN, Matjaž, GRUDEN, Kristina. Gene expression profiling in susceptible interaction of grapevine with its fungal pathogen Eutypa lata : extending MapMan ontology for grapevine. BMC plant biol. (Online), 2009, vol. 9, no. 104, str. 1-14. http://dx.doi.org/10.1186/1471-2229-9-104, doi: 10.1186/1471-2229-9-104. [COBISS.SI-ID 2058319]

SELJAK, Gabrijel, PETROVIČ, Nataša. Diffusione e stato della ricerca delle malattie da fitoplasmi in Slovenia = The presence of phytoplasma diseases in Slovenia and the situation of the research. Petria, 2000, letn. 10, št. 2, str. 133-139. [COBISS.SI-ID 12661721]

Poleg naštetih izvirnih znanstvenih člankov smo raziskave na fitoplazmah vinske trte predstavljali na različnih mednarodnih kongresih in simpozijih v obliki kratkih povzetkov, postrov in predavanj.